I. Nguyên lý của phương pháp:
Đây là phương pháp phát hiện nhanh sự có mặt của các thuốc trừ sâu lân hữu cơ và carbamate (nhóm có nhiều khả năng gây ngộ độc thực phẩm nhất) trong mẫu rau quả hoặc mẫu môi trường thông qua hiện tượng ức chế hoạt tính của enzyme acetyl-cholinesterase (AChE). Việc nhận biết sự có mặt các thuốc trừ sâu này được tiến hành bằng cách so màu (bằng mắt thường hoặc bằng máy so màu).
Sơ đồ nguyên lý của phương pháp như sau:
TTS lân hữu cơ hoặc carbamate + AChE ===> AChE bị ức chế + AChE tự do
Acetylthiocholine Iodine + H2O + AChE tự do ===> Choline + Acid Acetic
Choline + 5,5 dithio-bis-2-nitrobenzoic acid ===> 5-mercapto-2-nitrobenzoic
(màu vàng)
Để tăng độ ức chế enzyme, mẫu được cho phản ứng với Br2 trước khi tiến hành phân tích.
Phương pháp tiến hành đơn giản, cho kết quả nhanh, có thể giúp chọn lọc nhanh những sản phẩm an toàn có độ nhiễm thuốc trừ sâu lân và carbamate dưới 1ppm.
II. Quy trình phân tích:
1. Dụng cụ:
a. Cân điện tử (±0.1g)
b. Photometer đo được bước sóng 430-450nm
c. Pipette
d. Pipette 1 kênh : 100 ml
e. Pipette 1 kênh: 1-5ml
f. Máy xay sinh tố chịu được dung môi
g. Dụng cụ thuỷ tinh:
h. Ống đong 100ml
i. Phễu lọc thủy tinh Þ 10
j. Becher 100ml
k. Đồng hồ bấm giây
l. Bút đánh dấu
2. Hoá chất
a. Dichloromethan (AR grade) - để chiết mẫu
b. Than hoạt tính
c. Giấy lọc
d. Nước cất
e. Cuvet nhựa
Bộ kit thử bao gồm:
a. Men AchE
b. Cơ chất ACTI
c. Cơ chất DTNB
d. Đệm PBS
ü Đưa toàn bộ thuốc thử về nhiệt độ phòng
ü Không để các thuốc thử tiếp xúc ánh nắng
1. Cân 100g mẫu đã cắt nhỏ, cho vào máy xay sinh tố
2. Thêm 100ml dung môi CH2Cl2, xây tốc độ vừa phải khoảng 1 phút
3. Lọc qua bông gòn, thu khoảng 40 – 50ml dịch lọc vào ống đong
4. Thêm khoảng 1 muỗng cafe than hoạt tính để tẩy màu
5. Lọc lại lần nữa qua giấy lọc, thu được dịch trong suốt không màu, nếu còn màu thì thêm một ít than vào và lọc lại lần nữa.
6. Thêm 2 – 3 giọt nước Br2 vào dich lọc thu được phía trên lắc đều, chờ 5 – 10 phút để tách lớp.
7. Dùng pipet hút 5 ml dịch lọc cho vào cốc thủy tinh 100ml, để bốc hơi đến khô.
8. Sau đó hòa cặn lại bằng 3ml đệm BPS, lắc khoản 1 phút. Cho toàn bộ dung dịch vào cuvet nhựa
9. Thêm 100ml men AChE, chờ 3 phút
10. Tiếp theo cho 100ml ATCI và 100ml DTNB
11. Đo độ hấp thu quang (A) ở bước sóng 430 – 450nm đúng 5 phút sau khi cho 2 cơ chất ATCI và DTNB vào.
Màu đậm = ít hoặc không có thuốc trừ sâu
Màu nhạt = nhiều thuốc trừ sâu
- Tính tỉ lệ ức chế (%) so với mẫu không có thuốc trừ sâu:
- Lớn hơn 30% là mẫu không an toàn (> 1ppm)
- Nhỏ hơn 30% là mẫu an toàn (< 1ppm)
Tất cả thuốc thử của bộ kít dược bảo quản < 00C
6. Lưu ý
Ø Các thuốc thử cần ở nhiệt độ phòng khi tiến hành thí nghiệm, sau đó cần cho trở lại ngay vào tủ lạnh, không nên để bên ngoài quá lâu. Riêng đối với enzyme chỉ nên lấy ra 1 lượng vừa đủ dùng không nên để toàn bộ enzyme ra nhiệt độ phòng.
Ø Trộn đều cộng hợp một cách nhẹ nhàng, tránh tạo bọt.
Ø Không để các hoá chất tiếp xúc ánh nắng.
Ø Không dùng bộ kit khi đã quá hạn.
Ø Sử dụng pipette đúng sẽ giúp có kết quả đúng